实时荧光定量PCR检测

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实时荧光定量PCR(realtime-PCR)技术是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR检测常用的两种方法:染料法和TaqMan探针法。
 
 
一、实验原理
SYBRGreen I 染料法

结合于dsDNA双螺旋小沟区域;反应体系中游离的SYBR®Green I,几乎不发出荧光信号;只有扩增过程中掺入双链DNA的才会发出荧光信号;荧光信号强度与DNA分子数量成正比。

 

TaqMan探针法

TaqMan探针法核心是探针分子,TaqMan探针是单链DNA5’端偶联发光基团,3’端偶联淬灭基团,游离的完整探针是检测不到荧光信号的,发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭,探针被水解,发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时,模板链经热变性解链形成单链,TaqMan探针优先跟模板链退火,引物随后退火到模板上,之后进行链的延伸,延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性,遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针,发光基团会跟淬灭基团分开,因此荧光检测系统可以接收到荧光信号,每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。
TaqMan探针法的特异性除了由引物提供,更由探针分子保证,因其退火温度更高,所以TaqMan探针法特异性更好,在一个反应体系中加入多条探针,可以做多个基因同时检测。

 

二、实验流程
 
01
 
方案设计
02
 
引物设计
03
 
有效性检测
04
 
抽提样本totalRNA
05
 
反转录为cDNAqPCR检测

 

三、客户提供材料

1、新鲜或正确保存的样品(按照我们的要求提供)
2、检测基因信息,引物信息,内参要求

3、相关文献(可选)

 

四、提交给客户结果

1、客户提供的实验样本
2、实验原始数据
3、完整实验报告

2022年4月28日 13:30
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